Variabilidad del gen de la envoltura del VIH-1 en tres grupos humanos con diferentes conductas sexuales de riesgo para adquirir ITS-VIH / Envelope genetic variability of HIV-1 infecting human groups with differents risk sexual behaviour to adquire HIV-STD

Objetivo: Determinar la variabilidad genética del gen de la envoltura porción C2-V3-C3 (env) del VIH-1 infectando grupos humanos con diferente conducta sexual de riesgo para adquirir ITS-VIH. Materiales y métodos: Se seleccionaron 50 sujetos infectados con VIH-1 de los cuales 19 fueron hombres trabajadores sexuales (HTS), 8 mujeres trabajadoras sexuales (MTS) y 23 sujetos heterosexuales (SH). Se realizó la extracción de ADN genómico y la amplificación del gen env por PCR. Se identificó el subtipo genético por ensayo de movilidad de heterodúplex (HMA) y se confirmaron los resultados por análisis filogenético. Asimismo, se realizó el análisis de recombinación intragenética, diversidad y distancia genética en las tres poblaciones. Resultados: Se amplificó el gen env en 49 muestras (98 per cent) y se logró secuenciar el fragmento en 40 de ellas. Se observó que el 97,5 per cent de las muestras de VIH fueron subtipo B mientras que una muestra no pudo ser clasificada filogenéticamente. Asimismo, se encontraron pequeños tramos de recombinación en el gen env de VIH en MTS (33 per cent), HTS (43 per cent) y SH (45 per cent). El mayor índice de diversidad de nucleótidos (Pi) de env se encontró entre las muestras de VIH provenientes de SH y HTS (0,12 y 0,13 respectivamente). Conclusiones: Se encontró una mayor variabilidad genética del gen env de VIH-1 en las poblaciones de HTS y SH, sin embargo, el subtipo genético y la frecuencia de recombinación de este fragmento genético fue similar en los tres grupos estudiados.

Objectives: To determine the genetic variability of C2-V3-C3 envelope genetic portion (env) of HIV-1 from human groups showing different sexual behavior to acquire STD/HIV. Material and methods: Fifty HIV-infected subjects were selected, which nineteen of them were male sex workers (MSW), eight female sex workers (FSW), and twenty three heterosexual subjects (HS). DNA genomic was extracted and the gen env was amplified by PCR. Genetic subtype as identified by heteroduplex mobility assay (HMA) and confirmed by phylogeny. Likewise, intragenic recombination, diversity and genetic distance were analyzed for the three populations. Results: Forty nine (98 per cent) samples were successfully amplified by PCR but only forty were sequenced. HMA and phylogeny analysis revealed that 97.5 per cent of HIV-1 samples were subtype B, but only one sample remain unclassifiable. Likewise, short recombinant regions in gene env were found from FSW (33 per cent), MSW (43 per cent) and HS (45 per cent). Finally, HIV species infecting MSW and HS showed the highest diversity nucleotide between them (Pi) (0,12 and 0,13 respectively). Conclusion: This study revealed that env gene was highly variable in MSW and HS populations, however genetic subtype and recombination frequency were similar for the three groups.

Identificación molecular de mutaciones puntuales relacionadas con resistencia a drogas en VIH-1 de pacientes peruanos / Molecular identification of point mutations related to HIV-1 drug resistance in peruvian patients

Objetivo: Identificar mutaciones puntuales relacionadas con resistencia a drogas en VIH-1 de pacientes peruanos.Materiales y métodos: Se seleccionaron 11 muestras de VIH provenientes de sangre total de sujetos con tratamientoantirretroviral (ARV). Posteriormente se realizó la optimización de la amplificación de 337 pb del gen de la transcriptasareversa (tr) y 377 pb de todo el gen de la proteasa (prt). Los productos de PCR fueron secuenciados directamentepara el análisis de mutaciones de resistencia. Las secuencias finales fueron analizadas en programas de análisis demutaciones de la HIV Drug Resistance Database de la Universidad de Stanford. Resultados: La optimización de laconcentración de ADN (2,5 ng / μL) así como la concentración de magnesio (4 mM) fueron factores críticos para la amplificaciónde la tr y la prt respectivamente. De otro lado, el análisis de secuencia reveló la presencia de las mutacionesT215Y y la M184V en tr, implicadas en conferir resistencia a zidovudina (AZT) y estavudina (D4T) así como a lamivudina(3TC) y emtricitabina (FTC) respectivamente. En prt se observaron las mutaciones D30N y N88D implicadas enconferir resistencia a nelfinavir (NFV). Es importante señalar que sólo tres muestras de VIH-1 presentaron mutacionesde resistencia, las demás mostraron mutaciones compensatorias. Conclusiones: Se demuestra la existencia de mutacionesde resistencia a ARV a nivel de tr y prt de VIH-1 en sujetos peruanos que reciben terapia TARGA. Se requierende mayores estudios para establecer un perfil de resistencia a ARV en la población peruana.

Objective: Identify point mutations related to HIV-1 drug resistance in Peruvian patients. Materials and methods: A total of 11 HIV-1 positive samples were selected, all were obtained from the whole blood of subjects undergoing anti-retro viral (ARV) treatment. 337 gene base pairs (bp) from reverse transcriptase (rt) and 377 bp from the whole protease gene (prt) were optimized. PCR products were sequenced directly for the analysis of resistance mutations. Final sequences were analyzed in the University of Stanford HIV Drug Resistance Database programs. Results: Optimization of DNA concentration (2,5 ng / µL), as well as magnesium concentration (4mM) were critical factors for rt and prt amplification, respectively. On the other hand, the sequence analysis showed the presence of T215Y and M184V mutations in rt , implicated in zidovudine (AZT), stavudine (D4T), lamivudina (3TC) and emtricitabine (FTC) resistance, respectively. In prt, mutations D30N and N88D were observed. These mutations have been implicated in nelfinavir (NFV) resistance. It must be highlighted that only three HIV-1 positive samples showed resistance mutations. The remaining samples showed compensatory mutations. Conclusions: This study demonstrated the existence of ARV resistance mutations at the HIV-1 rt and prt levels in Peruvian patients undergoing HAART therapy. Further studies are required to establish an ARV resistance pattern in the Peruvian population.

Evaluación serológica de una proteína recombinante a partir de una cepa aislada del virus de la fiebre amarilla en el Perú: un estudio piloto / Serologic assessment of a recombinant protein from an isolated strain of yellow fever virus in Peru: a pilot study

Objetivo: Evaluar serológicamente una proteína recombinante de 66 kDa (Er66) de una cepa del virus de la fiebre amarilla aislada en el Perú usando anticuerpos inmunoreactivos. Material y métodos: La proteína Er66 fue expresada in virtro en la bacteria Escherichia coli y enfrentada a títulos de 1/100, 1/50 y 1/25 de anticuerpos monoclonales, y a sueros con anticuerpos IgM e IgG inmunoreactivos contra el virus de la fiebre amarilla mediante ensayos de Western blot (WB). Asimismo, se evaluaron proteínas totales de las cepas de referencia del virus dengue (DEN) y fiebre amarilla como controles de antigenicidad. Resultados: La proteína recombinante Er66 presentó antifenicidad contra títulos de 1/50 y 1/25 de anticuerpo monoclonal (MAB8701); sin embargo, no se observó inmunoreactividad en suerpos positivos para fiebre amarilla y dengue. Los ensayos con extractos crudos de la cepa de fiebre amarilla Asibi 17D (PFTA) revelaron que la antigenicidad de las proteínas virales comprendidas entre 60 y 80 kDA fue afectada negativamente a temperaturas desnaturalizantes de 100grados centígrados. En cambio, tratamientos con ß-mercaptoetanol sin calor generó un aumento de la antigenicidad de dichas proteínas. Siguiendo este mismo principio, la proteína Er66 fue sometida a tratamientos desnaturalizantes con ß-mercaptoetanol sin incluir calor y fue enfrentada nuevamente a los sueros reactivos. El resultado final reveló que la proteína Er66 generó generó inmunoreactividad frente a sueros con altos títulos de anticuerpos IgM e IgG para fiebre amarilla mientras que en otras muestras se observó una débil señal. Conclusiones: Los datos obtenidos en este trabajo demuestran que la Er66 pudo ser reconocida por anticuerpos frente a sueros con altos tíulos de anticuerpos IgM e IgG específicos para fiebre amarilla presentes en sueros de pacientes infectados. Los datos presentados en este artículo sugieren el uso de proteínas recombinantes como posibles candidatas de valor diagnóstico para la FA

Análisis genético del virus peruano de la fiebre amarilla / Genetic analysis of the peruvian yellow fever virus

Objetivo: Determinar las variantes genÚticas de aislamientos del virus peruano de la Fiebre Amarilla (FA). Materiales y mÚtodos: La región carboxiterminal del gen de la envoltura (E) de cinco aislamientos de FA obtenidas de pacientes provenientes de Ayacucho 1978 (PER1), JunÝn 1995 (PER2), Cerro de Pasco (PER3), Cusco (1998) y San MartÝn (1999) fue amplificada por PCR, secuenciada y analizada con programas software de ADN. Resultados: El Ýndice de similaridad de la secuencia de aminoßcidos presentó valores entre 97,6 por ciento y 99,7 por ciento de similiridad. El anßlisis filogenÚtico demostró una distancia genÚtica entre 0,40 y 6,50 mediante la secuencia de nucleótidos y, a travÚs de la secuencia de animoßcidos se observó un rango de 0,30 y 4,29. Sin embargo, las secuencias correspondientes a los sitios de glicosilación y a los apitopes de reconocimiento humoral fueron conservadas entre los cinco aislamientos, con excepción de algunos aislamientos de referencia reportados por otros autores. Conclusiones: Los virus de FA peruanos forman un grupo filogenéico distintoa otros virus de FA sudamericanos, basados en el anáisis genéico del gen E.

Síntesis in vitro de la proteína de la envoltura del virus peruano de la fiebre amarilla / In vitro synthesis of the envelope protein of the peruvian yellow fever virus

Objetivo: Sintetizar la proteína recombinante de la envoltura (Er) del virus peruano de la Fiebre Amarilla (FA) utilizando técnicas moleculares. Materiales y métodos: El gen de la proteína de interés fue amplificado por transcripción reversa - reacción en cadena e la polimerasa (RT-PCR) y clonado en un vector plasmídico para ser analizado mediante secuenciamiento de ADN. El inserto de ADN fue subclonado en un vector de expresión para ser traducido a proteína. Se purificó la proteína mediante cromatografía de afinidad bajo condiciones denaturantes, siendo visualizada por electroforésis en SDS-PAGE.Resultados: Se sintetizó y purificó la pr E del virus de la FA. Presentó un peso de && kDa, y luego de tres horas de inducción a partir de 1x10 células (OD=0,5) se obtuvo 10mg/mL de la proteína a miniescala. Conclusión: El análisis de la secuencia de aminoácidos demostró que Er podría ser un buen candidato a ser evaluado serológicamente y luego usado como herramienta de diagnóstico específico para la FA